聚焦GB 4789.9-2025彎曲菌檢驗：關鍵步驟操作要點與高效解決方案

1. 稱量與稀釋：準確稱取25g（果蔬、水產品除貝類取50g）樣品，加入裝有100mL無菌0.1%蛋白胨水的帶濾網均質袋中。

2. 均質與過濾：使用拍擊式均質器以規定力度均質1-2分鐘，使樣品充分破碎、菌體釋放。隨后通過均質袋自帶的濾網，將勻漿過濾至無菌離心管中，以去除大顆粒雜質。

3. 離心富集：將濾液在4℃、12000g條件下離心15分鐘，棄去上清。此步驟可重復以充分富集目標菌體。

4. 重懸：用1mL無菌生理鹽水重懸沉淀，取全部懸浮液加入9mL彎曲菌增菌液中。

5. 增菌培養：將彎曲菌增菌液置于微需氧環境（85%N?, 10%CO?, 5%O?）中，42℃±1℃培養24h±2h。

   
   

關鍵控制點：

1. 精準定量稀釋： 樣品稱量及稀釋步驟的準確性直接影響后續增菌效果的可比性。推薦使用HD-DT系列自動樣品稀釋儀，該儀器通過精密天平自動稱量樣品，根據稱量結果和設置的稀釋比例，自動計算需要加的稀釋液，并控制精密泵加裝稀釋液，操作簡便，為后續增菌環節的均一性與可靠性奠定堅實基礎。

2. 均質效率：均質的充分與否直接決定菌體釋放率。推薦使用HD-H15拍打式均質器，其拍擊間距、速度與時間可調，能針對不同食品基質的特性進行優化，確保均質效果均一、高效。

3. 低溫離心：全程需在4℃環境下操作，保持彎曲菌的活性。

4. 無菌操作：過濾、轉移、重懸等步驟需嚴格無菌，防止交叉污染。

5. 微需氧環境精準控制：這是成功分離的關鍵。彎曲菌對氧氣敏感，而傳統的微需氧培養方法（如產氣袋、手套箱）普遍存在“操作繁瑣"、“氣體消耗大"、“環境難控"等問題。

   推薦采用HD-AN系列智能厭氧/微需氧培養系統，可一鍵自動抽排置換氣體，快速、精確地建立并維持5%氧氣濃度的環境，且配套培養罐可脫機使用，銜接培養與轉運流程。

HD-AN系列 智能厭氧/微需氧培養系統

   濾膜培養法，是新標準為提升空腸彎曲菌和結腸彎曲菌分離選擇性而引入的重要技術。其原理是利用0.45μm孔徑的濾膜，允許體型纖細、具有特殊螺旋運動的彎曲菌通過，而大部分雜菌則被截留，從而顯著提高目標菌的檢出率。

（1）前期準備

1. 用無菌鑷子將0.45μm無菌濾膜平整貼附于哥倫比亞血瓊脂平板和卡瑪麗血瓊脂平板中央，確保無氣泡。

（2）過濾操作

1. 取300μL經42℃微需氧增菌24小時后的培養物，分4-6小滴滴加在濾膜上（勿超出濾膜邊緣）。

2. 在室溫下靜置45-60分鐘（微需氧或普通氣體環境），讓菌液充分滲透，期間切勿移動濾膜。

3. 用無菌鑷子小心移除濾膜。

（3）培養與觀察

1. 將平板立即翻轉，置于微需氧環境中，42℃±1℃培養24-48小時。

2. 培養24-48小時后，在兩種平板上尋找分散凸起、邊緣整齊發亮的可疑菌落（卡瑪麗平板上呈淡灰色，表面濕潤有金屬光澤；哥倫比亞平板上呈灰白色，濕潤有光澤）。

關鍵提示：

1. 必須保證足夠的液體滲透時間，時間不足可能導致細菌無法穿過濾膜。

2. 操作全程需嚴格無菌，微需氧環境的快速建立與穩定維持是方法成功的關鍵，直接影響目標菌的復蘇與生長。

（1）可疑菌落純培養

1. 從濾膜法培養后的平板上，挑取至少5個（不足5個則全挑）典型可疑菌落，分別劃線接種至新的哥倫比亞血瓊脂平板，以獲得單菌落。

2. 置于微需氧環境中，42℃±1℃培養24-48小時。

（2）革蘭氏染色與鏡檢（形態觀察）

1. 挑取純培養后的單個菌落，嚴格按照標準流程進行革蘭氏染色，隨后油鏡觀察。

2. 判定：彎曲菌屬應為革蘭氏陰性桿菌，菌體形態典型者可見S形、螺旋形或海鷗展翅狀（部分菌株形態可能不典型）。

（3）氧化酶試驗

1. 用非鐵質接種環（如鉑金環或一次性塑料環）挑取菌落，涂抹于被氧化酶試劑浸濕的濾紙上。

2. 判定：在10秒內，涂抹點出現紫紅色、紫羅蘭色或深藍色，即為陽性。

（4）有氧條件下25℃生長試驗

1. 挑取菌落接種至哥倫比亞血瓊脂平板，置于普通有氧環境中，25℃±1℃培養48小時。

2. 判定：培養后無菌生長為符合彎曲菌屬特性（陽性結果）。

關鍵控制點：

1. 確保獲得純培養物，這是所有后續鑒定試驗準確的前提。

2. 染色結果的清晰、準確至關重要，是排除其他革蘭氏陽性雜菌干擾的第一步。

   推薦使用HD-GM100全自動革蘭氏染色儀，提升鑒定流程的標準化、安全性與效率。

• 標準化染色流程：儀器自動完成涂片、固定、染色、脫色、復染及干燥全流程，確保每張玻片染色效果高度一致，消除人工操作差異。

• 高效批量處理：支持連續批量處理樣本，一鍵啟動即可自動運行，顯著提升實驗室檢測通量，解放人力。

• 安全與質量保障：封閉式操作有效減少試劑暴露和交叉污染風險；標準化輸出確保染色質量穩定，菌體形態清晰易辨，結果可追溯。

3. 氧化酶試驗中必須使用非鐵質工具，避免鐵離子導致假陽性；嚴格計時觀察。

   在獲得彎曲菌屬的可疑菌落后，標準中允許使用微生物生化鑒定系統替代傳統的過氧化氫酶、馬尿酸鈉水解、吲哚乙酸酯水解試驗等單項試驗，進行種水平的鑒定與確認。

1. 菌懸液制備：挑取純培養的可疑菌落，配制為符合系統要求濁度的菌懸液。

2. 試劑板接種：將菌懸液接種至專用生化鑒定試劑板（如革蘭氏陰性菌鑒定板或特定彎曲菌鑒定板）的微孔中。

3. 培養與讀數：將試劑板放入微生物生化鑒定系統配套的孵育倉/判讀器中，在適宜條件下培養一定時間（通常4-24小時）。

4. 自動分析與報告：系統通過自動感光比色及矩陣概率算法，讀取生化反應結果，并與內置數據庫比對，自動給出菌種鑒定結果及置信度。

   推薦使用HD-MT系列細菌麥氏濁度儀用于制備標準麥氏濁度的菌懸液，為細菌鑒定提供樣品質量保證。

HD-MT系列 細菌麥氏濁度儀

   此外，HD-MA系列自動微生物生化鑒定及藥敏系統配套的專用試劑板與數據庫，可準確鑒定空腸彎曲菌、結腸彎曲菌及其它常見微生物，極大提升了鑒定效率與標準化水平。

HD-MA系列自動微生物生化鑒定及藥敏系統

1. 標準化與高通量：此方法將多項繁瑣的手工試驗集成于一塊試劑板，實現了標準化和高通量操作。

2. 結果客觀：避免了人工判讀的主觀誤差，結果更客觀、可追溯。

   新標準在傳統生化鑒定基礎上，明確新增了實時熒光PCR與MALDI-TOF MS作為種水平鑒定（區分空腸彎曲菌與結腸彎曲菌）的確證方法，為實驗室提供了更高效、更精準的鑒定路徑。

   PCR方法可在數小時內獲得高特異性結果，是快速篩查與確證的理想選擇。

1. DNA模板制備（熱裂解法）：挑取1-3個純培養菌落，懸浮于500μL無菌去離子水中，100℃水浴/金屬浴加熱10分鐘，冰浴或室溫短暫冷卻后，8000-13000g高速離心10min取上清即為DNA模板。

2. PCR反應體系配制：嚴格按標準配制反應體系，需包含針對cj0415基因（空腸彎曲菌）和zupT基因（結腸彎曲菌）的特異性引物與探針。

3. 上機擴增：將反應管置于實時熒光PCR儀中，運行標準程序（94℃預變性30秒；隨后94℃變性5秒、60℃退火延伸30秒，循環40次）。

4. 結果判讀：根據FAM和VIC通道的Ct值及擴增曲線，判斷是否檢出目標基因。

關鍵控制點：

1. 防污染：PCR實驗需在獨立分區進行，嚴格防止氣溶膠污染。

2. 對照設置：必須同時設立陽性對照、陰性對照和空白對照，確保結果有效。

   彎曲菌屬內不同菌種的鑒定對于彎曲菌感染的防控和治療具有重要意義，針對不同菌種的PCR技術，手動配制反應體系繁瑣且易出錯。因此迫切需要一種能夠快速、準確、廣譜鑒定彎曲菌屬內菌種的方法。

   推薦使用彎曲菌六重核酸檢測試劑盒（探針法）等商品化試劑盒。該方案將多重PCR檢測與內標監控集成于單管單次反應中，不僅符合國標引物探針序列要求，還簡化了操作，極大地提升了檢測通量與效率。

   彎曲菌六重核酸檢測試劑盒（探針法）可用于包括彎曲菌屬、空腸彎曲菌、結腸彎曲菌、紅嘴鴨（海鷗）彎曲菌、烏普薩拉彎曲菌以及胎兒彎曲菌的檢測及鑒定。

  本試劑盒包含彎曲菌六重檢測液A、彎曲菌六重檢測液B、彎曲菌六重陽性對照、陰性對照，采用多重實時熒光PCR技術，對同一樣本采用A、B兩個三重熒光PCR反應檢測、鑒定是否含有重要的食源性彎曲菌屬內菌種，同時確定菌種是空腸彎曲菌、結腸彎曲菌、紅嘴鴨（海鷗）彎曲菌、烏普薩拉彎曲菌或者胎兒彎曲菌。

   MALDI-TOF MS通過分析微生物獨特的蛋白質指紋圖譜進行鑒定，是新國標推薦的另一項前沿技術，能將鑒定時間縮短至分鐘級。

1. 靶板樣本制備：

• 直接涂抹法：將少量純培養菌落直接均勻涂抹于質譜靶板點樣位。

• 甲酸提取法（推薦）：在菌落涂抹處加1μL 70%甲酸，干燥后再覆蓋1μL基質溶液（如HCCA）。

2. 上機檢測：將靶板放入質譜儀，儀器自動進行激光轟擊、數據采集。

3. 數據庫比對與鑒定：系統將采集的蛋白譜圖與內置數據庫進行比對，給出最可能的菌種鑒定結果及置信度評分。

   
   

關鍵控制點：

1. 樣本前處理一致性：前處理方法是影響譜圖質量的關鍵，需標準化。

2. 數據庫完整性：數據庫是否涵蓋目標菌種直接影響鑒定能力。

HD-M-Discover系列

微生物質譜快速鑒定分析系統

   為滿足新國標對MALDI-TOF MS方法的應用要求，HD-M-Discover系列微生物質譜快速鑒定分析系統提供了強大的技術支撐：

1.  優異性能，穩定可靠

   系統搭載高性能固體激光器與新一代控制芯片，確保激光發射穩定、靶板定位精準，保障儀器在各類實驗室環境下長期穩定運行。

2.  精準鑒定，技術先進

   依托“基因+蛋白+AI"三重技術，系統內置全新升級的菌種質譜圖數據庫及智能算法，對空腸彎曲菌、結腸彎曲菌等食源性致病菌的鑒定準確率顯著提升，并能有效識別罕見菌。

3.  極速高效，流程智能

• 高速檢測：單樣本檢測可低至6秒，整板（96樣本）最快10分鐘即可完成全自動鑒定，實現從“小時級"到“分鐘級"的效率飛躍。

• 全流程自動化：實現從樣本上機到結果輸出的一鍵式操作。硬件狀態實時監控與自動報警，最大限度減少人為誤差與操作門檻。

• 數據深度挖掘：除快速鑒定外，系統支持主成分分析、聚類分析等功能，為菌株同源性分析與疫情溯源提供強大數據支持。

青島中創匯科試劑

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